L’isolement/purification complet d’un “virus” est-il seulement possible ?

Lorsque l’on descend à la taille des nanoparticules et que l’on s’attend à des milliards de particules identiques à ce niveau, il serait logique de supposer que séparer complètement la particule exacte que recherche un virologue de tout le reste de l’échantillon est carrément impossible. Ainsi, demander aux virologues de purifier et d’isoler complètement les particules “virales” suspectées dans l’échantillon non altéré d’un patient malade peut sembler une tâche herculéenne et une demande injuste.

Cependant, c’est dans ce coin que la virologie et la théorie des germes se sont fourvoyées. Pour pouvoir affirmer qu’une particule particulière est un “virus” et peut provoquer les symptômes de la maladie qui lui est associée, la logique veut qu’elle soit complètement séparée de tous les autres variables/facteurs potentiels afin de prouver que cette particule particulière est bien la cause de la maladie. C’est la seule façon logique de montrer qu’aucune autre particule présente dans l’échantillon n’a pu être à l’origine de la maladie et, dans le cas de la génomique, que les séquences d’ADN/ARN n’appartiennent qu’à cette particule particulière que l’on croit être un “virus”.

Nous pouvons savoir si une purification/isolation complète est possible en examinant la recherche sur les exosomes et les méthodes utilisées. Les “virus” sont considérés comme des exosomes dans tous les sens du terme, car ils sont identiques en taille, en forme et en apparence. Les méthodes utilisées pour purifier/isoler les exosomes sont les mêmes que celles qui sont censées être utilisées pour les “virus” mais qui ne le sont jamais, surtout en l’absence de procédés de culture cellulaire toxiques. Ces méthodes sont considérées comme les meilleures méthodes de purification/isolement disponibles aujourd’hui.

Examinons brièvement quelques-unes d’entre elles :

Avancées et défis récents dans la récupération et la purification des exosomes cellulaires

“Bien que différentes approches pour la séparation, la purification et l’analyse des exosomes aient été explorées, il n’existe à ce jour aucune méthodologie offrant une robustesse suffisante en termes de rendement de purification, de sélectivité et de reproductibilité. En fait, en raison des propriétés biochimiques inhérentes de ces vésicules et des énormes différences entre elles qui dépendent de la matrice à partir de laquelle elles sont obtenues, il est généralement nécessaire d’adapter une combinaison de techniques pour obtenir les résultats de purification souhaités. Dans ce sens, différentes méthodologies physiques et/ou chimiques ont été étudiées et proposées pour obtenir un bon rendement de purification des exosomes. Ce travail vise à établir un état des lieux des stratégies d’isolement des exosomes en soulignant les avantages et les inconvénients de chacune des techniques les plus couramment utilisées tout en présentant une perspective d’avenir pour ce sujet important.”

“En outre, de nombreux défis se posent lors de l’isolement de ces particules d’origine naturelle. Par exemple, les exosomes appartiennent à un vaste domaine de vésicules extracellulaires, dont certaines présentent des propriétés physicochimiques qui se chevauchent 55. De plus, les exosomes eux-mêmes présentent une grande hétérogénéité en termes de taille, de charge et de marqueurs de surface.“

2.1. Ultracentrifugation

“L’étalon-or actuel pour l’isolement des exosomes est l’ultracentrifugation 58. Comme on le sait, cette technique exploite le principe du mouvement des particules dû à l’accélération gravitationnelle dans un champ inertiel 59. L’ultracentrifugation différentielle et l’ultracentrifugation en gradient de densité sont parmi les méthodes d’ultracentrifugation les plus couramment utilisées pour l’isolement des exosomes 60.

L’ultracentrifugation différentielle est communément appelée méthode de pelletisation, car elle permet d’obtenir des pellets contenant des exosomes. Elle est également appelée méthode d’ultracentrifugation simple car elle ne nécessite que plusieurs étapes d’ultracentrifugation 61. À ce jour, il s’agit de la méthode la plus largement utilisée pour isoler les exosomes et elle a été utilisée avec succès dans une variété de fluides biologiques et de milieux de culture cellulaire 62, 63. Pendant l’ultracentrifugation différentielle, les exosomes sont séparés en fonction de leur densité et de leur taille. Ainsi, une contamination par d’autres vésicules, molécules ou particules qui se chevauchent dans ces paramètres est attendue. Pour réduire la présence de débris cellulaires et de grandes vésicules, des étapes de nettoyage sont nécessaires avant la granulation des exosomes 64, 65, 66.”

“Selon ces résultats, une force g spécifique ne granule pas les exosomes avec la même efficacité dans différents types de rotors, et le temps de centrifugation doit être correctement pris en compte. Dans le cas contraire, la pureté de l’échantillon, le contenu en protéines et le rendement en exosomes seront compromis 68.”

“Il convient de noter que la force g utilisée lors des protocoles d’ultracentrifugation a un effet significatif sur la pureté et le rendement des exosomes 75. De plus, il a été constaté que l’efficacité de sédimentation des exosomes varie selon les lignées cellulaires. “

“Cependant, comme il a été mentionné, cette méthode n’est pas spécifique et la contamination par d’autres vésicules extracellulaires est inévitable. Si le protocole n’est pas bien standardisé et adapté (en termes de temps et de force gravitationnelle) aux caractéristiques de l’équipement utilisé, l’isolement des exosomes ne sera pas cohérent, et des pertes se produiront inévitablement 59.”

2.2. Stratégies basées sur la filtration

“L’ultrafiltration est une autre technique disponible pour obtenir des échantillons enrichis en exosomes à partir de diverses sources, notamment le milieu de culture cellulaire et les fluides biologiques 91. Dans ce procédé, les vésicules extracellulaires en suspension dans une solution peuvent être séparées par leur taille ou leur poids moléculaire. Habituellement, différentes forces sont appliquées pour les faire passer à travers (ou être retenues sur) une membrane sélective. La force centrifuge, la pression ou le vide sont généralement appliqués pour l’ultrafiltration à travers une membrane qui est généralement construite à partir de matériaux à faible affinité protéique.”

“Néanmoins, l’ultrafiltration, un protocole simple, est incapable d’isoler uniquement les exosomes, car les microvésicules et les corps apoptotiques seront également présents dans le produit résultant. De plus, de grandes quantités de protéines très abondantes, qui imitent la taille ou le poids moléculaire des exosomes, se retrouveront également dans la solution obtenue. Cette contamination résulte des limites physiques de la procédure et des propriétés superposées des particules dans la matrice traitée. En outre, les effets de la force appliquée et du contact avec la membrane sur les exosomes doivent être étudiés plus avant. Les déformations potentielles et les pertes d’exosomes dues à l’extrusion et à la liaison avec la membrane sont attendues 104.”

2.3. Précipitations

“La précipitation des exosomes est une technique récemment développée qui est maintenant la deuxième méthode d’isolement la plus utilisée après l’ultracentrifugation, très probablement parce qu’elle est assez facile à réaliser et ne nécessite pas d’équipement spécialisé ou coûteux 68. Cette technique a été développée à l’origine pour isoler des virus et d’autres macromolécules, mais les exosomes peuvent également être déposés à partir de fluides biologiques en utilisant les mêmes principes 115. La plupart des méthodes de précipitation consistent à mélanger l’échantillon, qui peut être un fluide biologique ou un milieu de culture cellulaire, avec un polymère hydrophile. Après le mélange, l’échantillon est incubé pendant une nuit à 4ºC, puis une centrifugation à faible vitesse est utilisée pour précipiter les exosomes qui sont ensuite remis en suspension dans le tampon préféré pour une analyse ultérieure 116. La protamine, l’acétate de sodium et les solvants organiques peuvent également être utilisés pour les procédures de précipitation 117, 118.”

“Il semble y avoir un consensus sur le fait que les méthodes basées sur la précipitation donnent le plus grand nombre de vésicules extracellulaires mais avec une faible pureté, comme cela a été constaté par rapport aux méthodes basées sur les colonnes 116. Ainsi, une autre approche consiste à incorporer ces méthodes après la précipitation pour purifier davantage l’échantillon.”

“Néanmoins, la faible pureté est un inconvénient majeur. La coisolation de contaminants non vésiculaires tels que les lipoprotéines et les complexes ribonucléoprotéiques, l’albumine, les immunoglobulines et d’autres protéines solubles est inévitable 126. La contamination par d’autres vésicules est également attendue. Malheureusement, cette contamination peut interférer avec les analyses biochimiques et immunologiques ultérieures. Dans ce contexte, la nécessité d’une purification plus poussée a donné lieu à des protocoles modifiés qui incluent des étapes de nettoyage avant et après l’isolement, ce qui allonge les procédures initialement rapides 127, et augmente également la charge de travail et les coûts.”

“En plus de la coisolation de contaminants non vésiculaires et d’autres vésicules, des études récentes ont trouvé une agrégation d’exosomes après précipitation 128, 129. Les agrégats d’exosomes peuvent également interférer avec l’analyse en aval. “

3. L’avenir des procédures d’isolement des exosomes

“L’isolement des exosomes reste un défi pour la recherche biomédicale. Il n’existe toujours pas de consensus sur la technique de purification qui donne les meilleurs résultats et la concurrence est intense dans ce domaine. De plus, une comparaison précise entre les méthodes ne peut pas être facilement effectuée en raison de la complexité inhérente aux exosomes.”

“De plus, la coisolation des contaminants devrait être minimale puisque la contamination est la complication la plus courante des techniques d’isolement actuelles 58. Presque invariablement, la coisolation d’autres vésicules et de molécules non vésiculaires se produit, interférant avec la comparaison des données entre les laboratoires de recherche 123.

Bien que l’ultracentrifugation soit actuellement la méthode de référence pour l’isolement des exosomes, il n’existe pas de méthode idéale pour tous les cas. Il n’existe pas de méthode idéale qui convienne à tous les usages. Le choix de la procédure dépend généralement des capacités et des ressources de chaque équipe de recherche et des sacrifices doivent être faits en termes de récupération, de pureté ou de charge de travail. En outre, l’analyse en aval peut être compromise par la technique d’isolement choisie 90. En ce sens, la sélection finale de la technique la plus appropriée pour l’isolement et la purification des exosomes doit tenir compte des effets que la méthodologie peut exercer sur l’intégrité de l’échantillon, en particulier pour l’utilisation finale prévue. Par exemple, les techniques de récupération telles que l’ultracentrifugation et la filtration ont tendance à produire une population de vésicules en forme de “soucoupe” ou de “ballon dégonflé” qui pourraient ne plus être utiles 157. En outre, l’intégrité de la charge exosomale, afin d’élucider les fonctions et les biomarqueurs spécifiques aux exosomes, doit également être prise en compte, même en l’absence de dégradation apparente 158. Cela est particulièrement vrai pour les techniques microfluidiques ou après l’isolement lorsque les exosomes sont stockés sous congélation ou dans d’autres conditions difficiles 159.”

4. Remarques finales

“Il existe actuellement différentes stratégies utilisées pour l’isolement et la purification des exosomes dont la sélection dépend de l’application prévue pour l’extrait exosomal. À ce jour, il est difficile d’identifier une stratégie qui donne la meilleure qualité et les meilleures propriétés des exosomes isolés et, généralement, une combinaison des différentes méthodologies est nécessaire pour obtenir les meilleurs résultats.”

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6972601/#!po=13.6667

En résumé :

Bien qu’il existe de nombreuses méthodes différentes utilisées pour la purification, il n’y a pas de méthodologie offrant suffisamment de robustesse en ce qui concerne le rendement, la sélectivité et la reproductibilité de la purification.
En général, une combinaison de techniques doit être adaptée pour obtenir les résultats de purification souhaités.
Les exosomes appartiennent à un vaste domaine de vésicules extracellulaires, dont certaines présentent des propriétés physicochimiques qui se chevauchent.
En outre, les exosomes eux-mêmes présentent une grande hétérogénéité en termes de taille, de charge et de marqueurs de surface.
L’”étalon-or” actuel pour l’isolement des exosomes est l’ultracentrifugation.
La contamination par d’autres vésicules, molécules ou particules qui se chevauchent est attendue.
Sans une force g appropriée, la pureté de l’échantillon, le contenu en protéines et le rendement en exosomes seront compromis.
La force g utilisée pendant les protocoles d’ultracentrifugation a un effet significatif sur la pureté et le rendement des exosomes.
L’ultracentrifugation n’est pas spécifique et la contamination par d’autres vésicules extracellulaires est inévitable.
L’ultrafiltration ne permet pas d’isoler uniquement les exosomes, car les microvésicules et les corps apoptotiques sont également présents dans le produit obtenu.
De grandes quantités de protéines très abondantes, qui imitent la taille ou le poids moléculaire des exosomes, seront également présentes dans la solution résultante.
Cette contamination résulte des limites physiques de la procédure et du chevauchement des propriétés des particules dans la matrice traitée.
Les méthodes de précipitation consistent à mélanger l’échantillon, qui peut être un fluide biologique ou un milieu de culture cellulaire, avec un polymère hydrophile.
Il semble y avoir un consensus sur le fait que les méthodes basées sur la précipitation produisent le plus grand nombre de vésicules extracellulaires, mais avec une faible pureté.
La faible pureté est un inconvénient majeur, car la coisolation de contaminants non vésiculaires tels que les lipoprotéines et les complexes ribonucléoprotéiques, l’albumine, les immunoglobulines et d’autres protéines solubles est inévitable et une contamination par d’autres vésicules est également attendue.
Les exosomes s’agrègent après la précipitation, ce qui peut également interférer avec l’analyse en aval.
L’isolement des exosomes reste un défi pour la recherche biomédicale et il n’y a toujours pas de consensus sur la technique de purification qui donne les meilleurs résultats.
Il est difficile d’établir une comparaison précise entre les méthodes en raison de la complexité inhérente aux exosomes.
La contamination est la complication la plus courante des techniques d’isolement actuelles.
Il se produit presque invariablement une coisolation d’autres vésicules et de molécules non vésiculaires.
Il n’existe pas de méthode idéale qui convienne à tous les usages et des sacrifices doivent être faits en termes de récupération, de pureté ou de charge de travail.
À ce jour, il est difficile d’identifier une stratégie permettant d’obtenir la meilleure qualité et les meilleures propriétés des exosomes isolés.

Gardez à l’esprit que les exosomes et les “virus” sont presque identiques en tous points. En fait, les exosomes ont été appelés “virus non infectieux”. La principale différence est que la recherche sur les exosomes tente régulièrement de les purifier à l’aide d’une ou plusieurs méthodes, alors que la virologie ne le fait pas. Cela dit, les trois méthodes susmentionnées sont inévitablement sujettes à la contamination par d’autres particules ainsi qu’à des dommages potentiels aux particules de l’échantillon. Les forces et les méthodes utilisées sur ces échantillons sont différentes de tout ce qu’ils rencontrent dans la réalité. Il est absolument impossible d’affirmer que les particules obtenues sont dans la même forme qu’au début du processus de purification/isolement.

La purification/isolement de ces particules est une tâche impossible. Il peut même être injuste de le demander. Cependant, la logique ne tient pas compte de l’équité. Pour prouver qu’un “virus” existe et cause une maladie particulière, il doit d’abord être complètement purifié/isolé à partir d’un échantillon non altéré.

Malheureusement pour la Virologie/Théorie des germes, ils ont la responsabilité peu enviable de montrer qu’il est possible de purifier/isoler complètement des particules considérées comme des “virus”. Aucune conclusion sur le caractère “viral” d’une particule ne peut être tirée avant cette étape logique. Jusqu’à présent, ils n’ont pas réussi à le faire à tous les coups.

Article original (anglais) : https://viroliegy.com/2021/09/20/is-complete-purification-isolation-of-a-virus-even-possible/